Synthesis of structured triacylglycerols enriched in n-3 fatty acids by immobilized microbial lipase

Abstract The search for new biocatalysts has aroused great interest due to the variety of micro-organisms and their role as enzyme producers. Native lipases from Aspergillus niger and Rhizopus javanicus were used to enrich the n-3 long-chain polyunsaturated fatty acids content in the triacylglycerols of soybean oil by acidolysis with free fatty acids from sardine oil in solvent-free media. For the immobilization process, the best lipase/support ratios were 1:3 (w/w) for Aspergillus niger lipase and 1:5 (w/w) for Rhizopus javanicus lipase using Amberlite MB-1. Both lipases maintained constant activity for 6 months at 4 °C. Reaction time, sardine-free fatty acids:soybean oil mole ratio and initial water content of the lipase were investigated to determine their effects on n-3 long-chain polyunsaturated fatty acids incorporation into soybean oil. Structured triacylglycerols with 11.7 and 7.2% of eicosapentaenoic acid + docosahexaenoic acid were obtained using Aspergillus niger lipase and Rhizopus javanicus lipase, decreasing the n-6/n-3 fatty acids ratio of soybean oil (11:1 to 3.5:1 and 4.7:1, respectively). The best reaction conditions were: initial water content of lipase of 0.86% (w/w), sardine-free faty acids:soybean oil mole ratio of 3:1 and reaction time of 36 h, at 40 °C. The significant factors for the acidolysis reaction were the sardine-free fatty acids:soybean oil mole ratio and reaction time. The characterization of structured triacylglycerols was obtained using easy ambient sonic-spray ionization mass spectrometry. The enzymatic reaction led to the formation of many structured triacylglycerols containing eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid or both polyunsaturated fatty acids.

Estudo comparativo da atividade antiinflamatória, ulcerogênica e citotóxica do S-ibuprofeno e ibuprofeno racêmico / Comparative study of anti-inflammatory, ulcerogenic and cytotoxic activities of racemate and S-ibuprofen

Ibuprofen is widely commercialized in racemic form. Although metabolic chiral inversion occurs through the conversion of R(-)-ibuprofen to S(+)-ibuprofen and the latter enantiomer is considered the active form, clinical trials involving the administration of a racemate to S-enantiomer dosage ratio of 1:0.5 have demonstrated that S(+)-ibuprofen is as efficacious as the racemic formulation. Moreover, the R(-)-enantiomer has been implicated in adverse gastrointestinal effects found with the racemic form, but the mechanisms involved in this process are not yet fully understood. The aim of the present study was to evaluate the anti-inflammatory activity of a racemate to S(+)-ibuprofen dosage ratio of 1:0.5 using the carrageenan air pouch model of inflammation and determine both ulcerogenic activity and the chiral conversion rate in rats. An in vitro study of the cytotoxicity of racemate and S(+)-ibuprofen in gastric cells was also performed. Although the plasma level of S(+)-ibuprofen was raised after racemate administration, no significant difference was found in anti-inflammatory activity, as assessed by exudate formation, PGE2 production and leukocyte migration to the air pouches. Fewer gastric lesions were found after S(+)-ibuprofen administration, despite the low gastric PGE2 content. In the in vitro study, the racemic compound proved more cytotoxic than S(+)-ibuprofen. The present findings suggest that the S-enantiomer of ibuprofen could be considered a therapeutic alternative to minimize gastrointestinal side effects, since the chiral inversion of R(-)-ibuprofen to S(+)-ibuprofen did not result in an improved anti-inflammatory response.

O Ibuprofeno é normalmente comercializado na forma racêmica. Embora ocorra inversão quiral convertendo a forma R(-)- em S(+)-ibuprofeno e, a última seja considerada a forma ativa, a administração da proporção 1:0,5 (racemato: S-enantiômero) demonstrou que o S(+)-ibuprofeno é mais eficaz que a formulação racêmica. Adicionalmente, o R(-)-enantiômero está envolvido nos efeitos adversos gastrintestinais descritos para a formulação racêmica, embora os mecanismos não sejam complemente compreendidos. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antiinflamatória da proporção 1:0,5 (racemato:S-ibuprofeno) utilizando o modelo experimental de bolsa de ar, a atividade ulcerogênica e a taxa de conversão quiral em ratos. Também estudamos in vitro, a citotoxicidade provocada pelo racemato e S(+)-ibuprofeno em células gástricas. Embora os níveis plasmáticos de S(+)-ibuprofeno tenham aumentado após a administração do racemato, a atividade antiinflamatória avaliada pela formação de exsudato, produção de PGE2 e migração de leucócitos para a bolsa de ar não foram diferentes. As lesões gástricas foram reduzidas após a administração de S(+)-ibuprofeno, apesar da inibição de PGE2 gástrica. In vitro, o composto racêmico foi mais citotóxico que o S(+)-ibuprofeno. Nossos resultados sugerem que o S-enantiômero do ibuprofeno pode ser considerado uma alternativa terapêutica visando a redução dos efeitos colaterais gastrintestinais, visto que a inversão quiral do R(-)- para o S(+)-ibuprofeno não resultou em melhora do efeito antiinflamatório observado.

Efeito antiedematogênico de óleos contendo ácidos graxos ômega-3 e 6 em camundongos / Antiedematous effect of oils containing the fatty acids omega-3 and 6 in mice

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito antiedematogênico tópico de óleos de semente de girassol, de uva, de prímula e óleo de peixe marinho, os quais apresentam em sua composição os ácidos graxos insaturados das famílias ômega-6 e ômega-3. Os ensaios farmacológicos, conduzidos nas orelhas dos camundongos, foram realizados após a aplicação prévia de um agente edematogênico, o óleo de cróton, e posterior tratamento com os óleos vegetais e de peixe utilizando o controle positivo (aplicação de dexametasona) e o controle negativo (aplicação de solução acetona/água 70:30). Os resultados revelaram valores de redução do edema em 31,5%, 29,2%, 20,4% e 7,3% para os óleos de girassol, uva, prímula e peixe, respectivamente, quando comparado ao grupo-controle negativo. Os óleos de girassol, uva e prímula, quando associados ao veículo cáprico-caprílico, mostraram melhora significativa no efeito antiedematogênico, com valores de redução do edema em 38,2% 40,6% e 30,2%, respectivamente (P<0,05). Portanto, foi evidenciado que o ácido linoleico, o principal ácido graxo da família ômega-6 presente nas amostras, associado com os ácidos caprílico e cáprico possui potente ação antiedematogênica tópica. Este efeito não foi observado para os ácidos graxos de cadeia longa da família ômega-3 presentes no óleo marinho.

Enzymatic resolution of (R, S)-ibuprofen and (R, S)-ketoprofen by microbial lipases from native and commercial sources

The enantioselectivity (E) of native lipases from Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, Mucor javanicus, Penicillium solitum and Rhizopus javanicus in the resolution of (R,S)-ibuprofen and (R,S)-ketoprofenenantiomers by esterification reaction with 1-propanol in isooctane was compared with known commercial Candida rugosa (Sigma) and Candida antarctica (Novozym®435) lipases. In the resolution of (R,S)-ibuprofen, C. rugosa lipase showed good selectivity (E = 12) while Novozym®435 (E = 6.7) and A. niger (E = 4.8) lipases had intermediate selectivities. Other enzymes were much less selective (E around 2.3 and 1.5), under tested conditions. After preliminary optimization of reaction conditions (water content, enzyme concentration and presence of additives) the enantioselectivity of native A. niger lipase could be enhanced substantially (E = 15). All tested lipases showed low selectivity in the resolution of (R,S)-ketoprofen because poor ester yields and low enantiomeric excess of the acid remaining were achieved.

A enantioseletividade (E) das lipases nativas de Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, Mucor javanicus, Penicillium solitum e Rhizopus javanicus na resolução dos enantiômeros do (R,S)-ibuprofeno e (R,S)-cetoprofeno na reação de esterificação com 1-propanol em isoctano foi comparada com as lipases comerciais de Candida rugosa (Sigma) e Candida antarctica (Novozym®435). A lipase de C. rugosa mostrou boa enantioseletividade (E = 12) comparada com as da Novozym®435 (E = 6.7), de A. niger (E=4.8) e com as outras lipases que foram muito menos seletivas (E por volta de 2.3 e 1.5) na resolução do (R,S)-ibuprofeno, dentro das condições testadas. Após uma otimização preliminar das condições da reação (conteúdo de água, concentração da enzima e presença de aditivos) a enantioseletividade da lipase de A. niger pôde ser substancialmente aumentada (E = 15). Todas as lipases testadas mostraram baixa seletividade na resolução de (R,S)-cetoprofeno, resultando baixos rendimentos de éster e de excesso enantiomérico do ácido não esterificado.

Isolamento e seleção de microorganismos produtores de lipase como biocatalisadores na hidrólise parcial de óleo de sardinha / Isolation and selection of lipase producing microorganisms as biocatalysts in the partial hydrolysis of sardine oil

O trabalho descreve o isolamento e a seleção de microorganismos produtores de enzimas lipolíticas e a utilização do extrato enzimático bruto como biocatalisador na hidrólise do óleo de sardinha brasileiro. A biocatálise tem por objetivo enriquecer o óleo em ácidos graxos pliinsaturados, os quais possuem efeitos benéficos em doenças cardiovasculares, processos inflamatórios e alérgicos. Os produtos resultantes da hidrólise foram analisados por cromatografia gás-liquido. Dentre as quatrocentos e vinte e cinco amostras de fungos isoladas e testadas, uma delas (nº 122) foi capaz de produzir modificações favoráveis na composição em ácidos graxos de sardinha, mostrando-se promissora no enriquecimento de ácidos graxos poliinsaturados.

Bioconversão de ácidos graxos em metilcetonas por nova linhagem de Aspergillus sp / Bioconversion of fatty acids to methyl hetones by new strain of Aspergillus sp

As metilcetonas são as principais responsáveis pelo aroma dos chamados "Blue Cheese". Essas substâncias são produzidas por microrganismos adicionados durante o processo de maturação desses queijos. O presente trabalho relata a formação e monitoramento dessas metilcetonas por uma nova linhagem de Aspergillus sp. O biocatalisador foi testado para a produção de metilcetonas adicionando-se 1 ml dessa suspensão em frascos tipo penicilina juntamente com 1 g de creme de leite de vaca e 9 ml do tampão adequado. Foi constatado que as melhores condições de produção de metilcetonas foram suspensão enzimática bruta, pH 4,5 por 96 horas a 30ºC, obtendo-se de 3,4 mg de 2-nonanona por 1 g de creme de leite de vaca.

Enhancement of Gamma-linolenic acid production by the fungus Mucor SP LB-54 by growth temperature

As a relatively prolific producer of GLA, the strain of Mucor sp LB-54 was selected for a study at different growth temperatures in shaker flask culture. The strain used in our experiemnt was capable to accumulate a relatively high amount of intracellular lipid, 20,73 per cent of dry cell weight, and GLA content of 15 per cent of total fatty acids after 5 days of incubation at 28 degree C. As the growth temperature was decreased from 28 to 12 degree C the percentage of GLA increased from 15 to 24 per cent of total fatty acids. In order to optimize the culture conditions for rapid biomass production and lipid production with a high proportion of GLA, the fungus was grown at two temperature combinations associated supplies of carbon source (glucose) in the culture medium. Maximal production of (GLA) (74 mg/l) was obtained from the Mucor sp LB-54 strain after 5 days of incubation at 28 degree C in basal medium following glucose addition (7 per cent w/v) and incubation for an additional 3 days at 12 degree C. The identity of GLA found in the strin of Mucor sp LB-54 was confirmed by the coupled gas chromatography-mass spectrometry.